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选择AAV血清型应根据目标细胞类型和组织来决定。例如,AAV2常用于肝脏、AAV8适用于肌肉、AAV9适用于心脏和中枢神经系统。通过参考文献或初步实验,确定最适合的血清型。
AAV滴度可以通过多种方法测定,如实时PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒斑形成单位(PFU)测定等。选择合适的方法应根据具体实验需求和实验室设备条件。
可能原因:
1. 蛋白翻译后修饰复杂,细胞未能正确处理而导致蛋白被降解
2. 蛋白质含有特殊序列(如高度重复序列),导致蛋白表达低或不正常
3. 表达系统不合适
哺乳动物细胞蛋白表达体系可表达的蛋白大小范围通常在10 kDa到150 kDa之间。
杆状病毒-昆虫细胞表达系统能够表达具有完整生物学功能的蛋白质,适合容纳和表达较大的外源片段,是表达大片段DNA的理想选择。
虽然杆状病毒-昆虫细胞系统不具备哺乳动物细胞的所有翻译后修饰能力,但它能够进行一些基本的翻译后修饰,如糖基化和磷酸化,适合大多数功能研究和生产应用。
酵母表达系统兼具原核和高等真核系统的优点,具有培养条件普通、生长速度快、成本低、可进行蛋白翻译后加工、易获得可溶性活性重组蛋白等特点。
巴斯德毕赤酵母因其快速生长、商业化表达载体丰富和高效分泌表达的优点,成为酵母表达重组蛋白的优先选择。
原核蛋白表达系统(如大肠杆菌)具有快速、高产量、经济实惠等优势,适用于大规模蛋白生产。
可以采用密码子优化、改变表达宿主菌株、调整表达条件(如温度、培养基组分等)等方法来提高可溶性蛋白的表达水平。
在大肠杆菌表达系统中,部分外源蛋白可能会由于错误折叠而形成包涵体,主要原因包括外源蛋白的复杂结构或毒性。
1. 提高蛋白表达量:密码子优化可以显著提高外源基因在宿主细胞中的表达量,为后续的分离纯化等步骤提供便利。
2. 提高翻译效率:通过减少稀有密码子的使用,可以避免翻译过程中的瓶颈,提高整体的翻译效率。
3. 改善mRNA稳定性:优化后的mRNA二级结构更加稳定,有利于核糖体的结合和翻译过程的顺利进行。