RNA干扰（RNAi）是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，指利用内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失。RNA干扰作为一种新型且强大的基因沉默工具，广泛应用于生物学和治疗学研究，特别是针对癌症或其他疾病治疗中的无成药性靶标。

RNA干扰的发现历程

• 1984年，反义RNA被发现能够抑制基因的表达，且双链RNA比单链RNA效果更佳。

• 1990年，Jorgensen研究小组在研究时，推测外源查尔酮合成酶基因抑制了内源基因表达。

• 1992年，Romano和Macino在粗糙链孢霉中观察到类似现象。

• 1995年，Guo和Kemphues在线虫中也观察到了RNA干扰现象。

• 1998年，Andrew Z. Fire等在秀丽隐杆线虫（C.elegans）实验中揭示双链RNA的抑制效果强于正义或反义RNA，推测存在扩增效应和酶活性参与，并命名为RNA干扰。

RNA干扰家族成员

RNA干扰由转运到细胞质中的双链RNA激活，表现为小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）诱导实现靶mRNA降解的基因沉默；小RNA（miRNA）诱导特定mRNA翻译的抑制；短反义核酸（siRNA和shRNA序列）对锁定细胞的mRNA进行降解阻断了该蛋白的进一步表达/聚集，导致其水平的下降，最终实现抑制作用。

siRNA VS miRNA

RNA干扰的技术要点

siRNA设计

• 严格配对：siRNA反义链与靶基因需严格碱基配对，避免单碱基错配。

• 特异性：设计siRNA时，确保其与靶基因高度同源，减少与其他基因同源性。

• 序列选择：

1. 从AUG下游找AA双核苷酸，及其后19个核苷酸作为模板。

2. 每个基因选4-5个序列，通过生物信息学筛选特异性最强的。

3. 避开5'和3'非翻译区及起始密码子附近，减少调节蛋白竞争。

siRNA合成    

体外制备

• 化学合成：适用于已知有效序列，成本高，周期长。

• 体外转录：成本较低，速度快，毒性小，稳定性好，效率高。

• RNase III消化：快速经济，用于研究基因功能缺失，可能引发非特异沉默。

体内表达    

1. siRNA表达载体    

多数siRNA表达载体采用RNA聚合酶III（pol III）启动子，如人/鼠U6和人H1，这些启动子擅长在哺乳动物细胞中表达小分子RNA，并以一串（3-6个）U终止转录。构建时需订购两段编码shRNA的DNA单链，退火后克隆至载体pol III启动子下游，过程耗时数周至数月，需测序验证。该载体优点在于长期研究潜力，带抗生素标记的可持续抑制靶基因数周至更久。病毒载体则高效感染细胞，提升转染稳定性和效率，适合基因沉默研究。

最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。

不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。

2. siRNA表达框架    

siRNA表达框架（SECs）为PCR产物，集成了RNA pol III启动子、发夹结构siRNA及终止位点，无需载体克隆即可直接导入细胞表达。相比传统载体，SECs省去了克隆、测序等耗时步骤，快速高效，是筛选siRNA及优化启动子-siRNA组合的理想工具。若PCR设计时加入酶切位点，筛选出的高效siRNA可便捷克隆至载体，构建稳定表达载体，用于长期抑制研究。这个方法的主要缺点是：

（1）PCR产物很难转染到细胞中；

（2）不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。

最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子。

不适用于：长期抑制研究（如果克隆到载体后就可以了）。

RNA干扰（RNAi）技术的应用

RNAi因其在基因沉默上的高效与简便性，成为基因功能研究的利器。它模拟药物抑制标靶基因（疾病基因）的机制，采用功能丢失（LOF）策略优于传统功能获得（GOF）法，故在制药业中尤为关键，用于药物靶标验证。有效的siRNA/shRNA不仅助力靶标识别，更可潜力转化为RNAi药物。

RNAi技术在药物靶标发现与验证中广泛应用，企业常利用RNAi文库筛选细胞，通过表型变化识别功能基因，如抑制肿瘤生长的基因。若靶标具备成药潜力（如膜蛋白或分泌蛋白），则进一步开展大规模药物筛选。同时，RNAi技术也用于细胞及动物模型中对靶标的二次验证。

临床应用中，双链小分子RNA/siRNA已试用于多种疾病治疗，如老年黄斑变性、ALS、类风湿性关节炎及肥胖等。在抗病毒及神经系统疾病（如帕金森病）的治疗探索中，RNAi疗法初显成效，肿瘤治疗领域亦取得进展。

豪利777生物

RNAi设计与合成

豪利777生物提供高度定制化的siRNA和miRNA合成服务，通过精湛工艺和严格质检确保产品优质。我们提供多样化、经化学修饰的siRNA，如磷酸、核糖和碱基修饰，以增强其体内稳定性和效果。同时，我们也供应多种miRNA产品，包括模拟物、抑制剂和对照品，以满足不同研究需求。

参考文献

DOI: 10.1631/jzus.B1700594.